CCK8檢測的試劑可用于簡(jiǎn)便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】。它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細胞增殖和毒性分析。
一、CCK8檢測的實(shí)驗內容：
取生長(cháng)狀態(tài)良好的對數生長(cháng)期細胞，每孔按 4×103個(gè)接種至 96 孔板中，每組設置8個(gè)復孔，置于細胞培養箱中培養，待細胞貼壁后轉染相應質(zhì)粒后。繼續培養 48h 后，棄含藥培養基，每孔加入新鮮配制的含 10ｕL的毒性檢測液CCK8，置于培養箱中繼續培養 4h 后，用酶標儀測波長(cháng)為450 nm的OD值。實(shí)驗重復 3 次， 取實(shí)驗結果的平均值作為實(shí)驗結果。按公式計算生長(cháng)抑制率＝[(對照組 OD－實(shí)驗組 OD)/對照組 OD] ×100%，以分組為橫坐標，生長(cháng)抑制率為縱坐標，繪制細胞生長(cháng)抑制率柱狀圖。
當使用標準96孔板時(shí)，貼壁細胞的較小接種量至少為1000 個(gè)/孔(100μl培養基)。檢測白細胞時(shí)的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2500 個(gè)/孔(100μl培養基)。酚紅和血清對CCK8法的檢測不會(huì )造成干擾，可以通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
二、CCK8檢測的注意事項
CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細胞。在細胞增殖實(shí)驗每次測定的過(guò)程中需要避免細菌污染，以免影響結果。CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保存1年。當在培養箱內培養時(shí)，培養板較外一圈的孔較容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，較外一圈的孔只加培養基，不作為測定孔用。在培養基中加入CCK8，培養一定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實(shí)驗時(shí)，還應考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養基中加入CCK8，培養一定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。金屬對CCK-8顯色有影響：當終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì )抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話(huà)，將會(huì )100%抑制。懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數量和延長(cháng)培養時(shí)間。
