一步法快速WB（HRP）試劑盒（鼠）說(shuō)明書(shū)

One Step Western Kit HRP（Mouse）

目錄號：  K2030     

保   存：  2 - 8  ℃，避免冷凍

組分說(shuō)明

Cat. No.           K2030          K2030A        K2030B

Kit Size              10           2             50

封閉液               125 ml        30 ml         500 ml

抗體反應液            HRP（鼠）     1 ml         200  μl      5×1 ml

抗體稀釋液            125 ml        30 ml        500 ml

漂洗液（10×）        125 ml        30 ml         500 ml

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

      一步法快速WB 試劑盒（鼠）是上海研謹生物xin推出的Western  Blot 檢測試劑盒，能夠在1 小時(shí)左右得到高質(zhì)量的 Western Blot 結果，且操作簡(jiǎn)便、檢測靈敏度高、背景低、不需再加入二抗、系統穩定性強。常規的Western Blot 間接 法檢測過(guò)程（封閉、一抗結合和二抗結合）需要較長(cháng)的時(shí)間，實(shí)驗流程復雜且需要多步條件優(yōu)化。膠上的蛋白轉移到載體膜上后，使用試劑盒中的封閉液孵育5 min，再用抗體反應液處理后的一抗孵育載體膜，經(jīng)洗滌三次（每次5  分鐘）后，即可進(jìn)行發(fā)光或顯色檢測。本試劑盒針對目的蛋白一抗為鼠來(lái)源的實(shí)驗系統使用。

注意事項

 1.  客戶(hù)自己準備鼠來(lái)源的一抗。

 2.  使用封閉液、抗體稀釋液（鼠）、漂洗液之前請充分混勻。

 3.  漂洗液如在2-8  ℃保存時(shí)出現沉淀，請恢復到室溫，把沉淀溶解后正常使用，1×漂洗液可在室溫保存一個(gè)月。

 4.  建議轉膜完成后用麗春紅等試劑染色，并把膜上多余部分剪去以增加試劑的使用效率。

 5.  一抗和抗體反應液HRP（鼠）需要通過(guò)預實(shí)驗來(lái)確定jia的稀釋用量。

 6.  抗體反應液HRP（鼠）、抗體稀釋液和抗體用量可根據膜的大小按比例放大或減少。

 7.  加入一抗的抗體稀釋液可以回收重復使用一次。特異性及親和力不好的抗體建議不重復回收使用?；厥蘸罂贵w如在1-2天內使用放置在2-8  ℃，長(cháng)期保存請在-20℃凍存，避免多次反復凍融。

 8.  如果存在較高背景的情況，請調整抗體的用量，并增加洗膜次數。

 9.  試劑盒內所有試劑請于2-8  ℃保存，避免凍融。

 操作步驟

 本產(chǎn)品適用于轉膜完成后的封閉及抗體孵育步驟，以5 cm×8 cm  膜為例：

 1.  漂洗液準備：取10 ml 10×漂洗液用蒸餾水稀釋至100 ml，待用。每次洗膜用8-10 ml。

 2.  轉膜完成后，將膜浸沒(méi)到10 ml封閉液中，室溫封閉5分鐘。

 3.  倒掉封閉液，加入8-10 ml 1×漂洗液，于搖床上用較大速度漂洗1分鐘。

  4.  洗膜的同時(shí)可準備抗體孵育液：取抗體反應液HRP（鼠）100μl到EP管中，加入鼠源一抗3-10μg，槍頭吸打至充分混勻，室溫孵育5分鐘。

  5.  將混勻的抗體與反應液HRP（鼠）混合液加入到10 ml  抗體稀釋液中，充分混勻。

   注意：1）一抗的用量也可根據抗體的稀釋度來(lái)進(jìn)行調整。以抗體的終稀釋度1:1000為例，取100μl抗體反應液HRP（鼠）到EP管中，加入10μl一抗，加入到10 ml  抗體稀釋液中，充分混勻，室溫孵育5分鐘。

2）如果膜面積較小，可按比例減少抗體、反應液及稀釋液的用量。

6.  步驟3中，洗膜完成后，倒掉漂洗液，將一抗、反應液及稀釋液混合而成的抗體孵育液加到膜上（確保孵育液*浸沒(méi)膜表面），在搖床上以適當速度室溫孵育40分鐘。

  7.  棄去（回收）抗體稀釋液，用1×漂洗液漂洗3-5次，每次3分鐘。

  8.  進(jìn)行后續檢測。建議采用ECL或者沉淀型TMB法進(jìn)行檢測。

應用實(shí)例

A:  普通WB對照：beta-actin鼠單抗（YJ0096）5ug室溫孵育40min，洗膜后二抗羊抗鼠-HRP

（YJ0102）1：10000稀釋?zhuān)覝?0min，ECL（YJ0049）曝光

B:  一步法WB： beta-actin鼠單抗（YJ0096）5ug 室溫孵育40min ，ECL（YJ0049）曝光

實(shí)例一  抗原為         293T 細胞全裂解液（YJ0065） 

 C：普通 WB 對照：GST 鼠單抗（K0084）2.5ug 室溫孵育40min，洗膜后二抗羊抗鼠-HRP

（K0102）1：10000 稀釋?zhuān)覝?0min，ECL（K0049）曝光。

D：一步法WB：  GST 鼠單抗（K0084）2.5ug  室溫孵育40min ，ECL（K0049）曝光。

實(shí)例二  抗原為         E.coli 多標簽蛋白裂解液（K2016） 

常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法  

問(wèn)題：信號太弱或者看不到條帶                                                      

可能原因：

a蛋白上樣量太少

b蛋白轉膜效率太低

c一抗親和力較低

解決方案：  

A 進(jìn)行SDS-PAGE電泳時(shí)加大上樣量。

B 優(yōu)化轉膜時(shí)間或者電流，確保轉膜時(shí)膜與膠之間沒(méi)有氣泡。  

C 增加膜在溶液（含有mixture 1的WB-2）中的孵育時(shí)間。 增加抗體濃度可

   以增加信號。

D 對于低親和力抗體來(lái)說(shuō)，減少洗膜時(shí)間可以增加信號。由每次10min，減少到每次5min     可以增加信號。  

問(wèn)題：背景偏高

可能原因：

a 一抗使用過(guò)量                      

b一抗有非特異性結合或者與封閉試劑有交叉反應     

c洗膜時(shí)間太短

d曝光顯影時(shí)間過(guò)長(cháng)

e容器或者試劑被污染

解決方案：

A  減少一抗的使用量，相應的減少WB-1用量。

B  使用 pretreat A-b（M01052）?？蛻?hù)還可以使用 Quick Block Optimization kit 來(lái)找到j(luò )ia的封閉試劑。

C  增加洗滌的步驟可以進(jìn)一步的降低背景。

D  減少曝光時(shí)間。如果信號和背景都高，可以等待一段時(shí)間，等背景信號減弱后，再進(jìn)行  曝光。

E  每次洗滌的時(shí)候使用清潔的容器。帶手套，使用清潔的鑷子處理膜。

實(shí)驗代做服務(wù)：