細胞培養的基本知識

操作前準備工作：

1.玻璃吸管和玻璃培養瓶的消毒：1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上；2)干烤消毒140度2小時(shí)以上；

2.無(wú)菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線(xiàn)照射40分鐘以上；各種培養板照射3小時(shí)以上；

3.培養基(pH7.2)和血清配制好后要做無(wú)菌試驗：將血清按10%加入培養基內，用無(wú)菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養基5-10ml置培養箱內培養2-3天，肉眼見(jiàn)無(wú)渾濁或沉淀等異物。分裝后置-20度保存；

4.消化液(pH7.8)或其它加入液，應用高壓蒸汽滅菌或一次性無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，分裝成支置-20度保存；

5.各種凍存的液體復溫時(shí)應邊搖邊融化，否則有的液體（特別是培養基）容易產(chǎn)生沉淀；

6.培養箱應先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外線(xiàn)的應照射1小時(shí)以上，如有高溫滅菌的應按程序來(lái)菌）至少每月一次；

7.進(jìn)入操作時(shí)應注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作時(shí)注意無(wú)菌臺內空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來(lái)往，如果數量較多，培養瓶應放在與酒精燈平行地方便于操作，瓶與瓶之間應相隔一定的距離，開(kāi)瓶（蓋）時(shí)應先用75%酒精反復擦拭或用燈燒，開(kāi)開(kāi)后應用燈先燒口，然后燒蓋用完后同樣操作，整個(gè)操作過(guò)程盡量在無(wú)菌臺靠里面一點(diǎn)。

復蘇：

1.應遵守慢凍快融的原則，先將水溫鍋調至37-37.5度，取出凍存的細胞迅速放入后交細胞面浸至水面以下不斷搖動(dòng)至融化；

2.在無(wú)菌臺內將完全培養基加入50ml的小培養瓶?jì)?，約5ml左右，然后用無(wú)菌吸管從凍存管內取出細胞，置培養并內輕輕搖晃，使細胞均勻后置培養箱內培養。

傳代：

1.貼壁細胞：

對于貼壁細胞應先吸（倒）盡培養基，吸的越干凈越好，以免中和后加入的消化液，使強度減弱，50ml培養瓶加入消化液約0.6ml，按此比例進(jìn)行消化，（根據配制強度經(jīng)驗），晃動(dòng)使消化液鋪均勻置37度培養箱約2分鐘，鏡下見(jiàn)細胞收縮變圓或少數脫落后，輕輕振動(dòng)瓶底使細胞全部脫落，加入2-3ml完全培養基后，輕輕吹打，使細胞基本成單個(gè)懸浮，然后分置其它無(wú)菌培養瓶?jì)?，加入完全培養基后繼續培養或實(shí)驗。

2.懸浮細胞：

一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養瓶?jì)?，加入完全培養基繼續培養，如要高濃度可先離心500rpm，5min后加入完全培養基，輕輕吹勻后，分置其它培養瓶?jì)燃尤胪耆囵B基繼續培養。

無(wú)菌操作：

簡(jiǎn)要介紹：

1.將試驗用品放入超凈工作臺用紫外線(xiàn)照射30分鐘；2. 照射30分鐘后，進(jìn)入緩沖間，換滅菌的無(wú)菌衣，換專(zhuān)用拖鞋；3.手部用5％的潔爾滅浸泡2分鐘，進(jìn)入潔凈區后，用75％的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩；5.操作時(shí)盡量靠近火焰；6.裝培養基的瓶子等不要直接口向上，用一個(gè)架子斜放，瓶口朝向火焰；7.標準操作，不要讓無(wú)菌吸管到處碰來(lái)碰去；8.中途出入無(wú)菌室，再次操作時(shí)，一定要再次用75％的酒精棉球消毒。

活細胞計數：

1、先消化吹打使細胞盡量變成單細胞懸液；

2、取出細胞液按你的濃度加入臺盼蘭置室溫5分鐘左右；

3、準備好潔凈的計數板及蓋玻片放在一旁，用玻璃滴管吸取染好并輕輕吹勻的細胞液，將滴管尖端輕輕靠在蓋玻與計數板的縫隙間，微微捏一下滴管膠頭細胞自動(dòng)就被吸到計數板里了（捏重了細胞不均勻，計數不準，細胞還會(huì )流出）。

4、在鏡下計數。

四角的4個(gè)大方格內細胞總數÷4×10000=你滴入時(shí)細胞液每ml的細胞數。

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